一种抗阿片肽的拮抗肽与该拮抗肽的应用（一）

发布时间:2015-12-02

　　专利号：ZL201010122615.3

　　类型：发明

　　专利权人：北京大学  陈玉珍；吴才宏；曲红

　　项目简介：

　　该发明涉及肽段及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有拮抗吗啡抗伤害作用的抗阿片肽及其拮抗肽，与该拮抗肽在制备具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物中的应用。

　　众所周知，在世界范围内猖獗的贩毒吸毒活动已成为危害社会的一个毒瘤，严重干扰了有序的经济建设和社会安定，此外，静脉吸毒还造成了艾滋病人群感染率的攀升。目前，各国政府虽都加大联合打击毒品走私的力度，但吸毒、贩毒活动仍屡禁不止，其中一个重要的原因就是吗啡耐受及依赖的原理尚未真正或完全被阐明，国际上尚无有效的戒毒手段。国外最先采用的”替代疗法”是在戒毒过程中用美沙酮一类的药代替阿片，这种疗法将导致病人对美沙酮类药物的耐受和依赖。在国内，宁波戒毒所杨国栋先生采用东莨菪硷配合其它药物戒毒，也未完全解决心瘾问题。韩济生教授采用针灸治疗仪治疗戒断症状，试图通过特定频率的电脉冲刺激提高体内内源性阿片的合成来减轻症状，但它的最大缺陷是人群中针刺镇痛的有效率有限而且持续地针刺也存在耐受问题。近来，石家庄中医药专家王岩对阿片戒断症状进行辩症施治，采用“金甲丸”治疗戒断综合症，正在经临床进一步检验和完善。因此，迫切需要一种可从源头上彻底消除吗啡耐受及依赖，以及减弱或消除戒断症状的戒毒药物。

　　已知PEBP家族的蛋白，在自然界里广泛存在于酵母、线虫、果蝇及各种植物及哺乳动物的不同器官，它们极具保守性，与其它已知结构或功能的蛋白的序列无同源性。PEBP蛋白的生物功能十分多样，在植物它对开花信号及分生组织生长的信号起调节作用。在哺乳类动物，PEBP蛋白可通过Raf-1抑制MEK的磷酸化使之不被激活，故又有Raf激酶抑制蛋白(RKIP)之称，它调节Raf/MEK/ERK一组信号，与细胞的有丝分裂和分化有关，涉及肿瘤细胞的转移。在中枢神经系统，PEBP蛋白不仅作为海马刺激胆碱能神经肽(HCNP)的前身蛋白，而且也作为ATP，阿片和磷脂酰乙醇氨的结合蛋白。

　　著名科学研发人指出在离体内侧隔核，海马胆硷能刺激神经肽(HCNP)提高胆硷乙酰化酶(ChAT)的产物而不是胆硷脂酶(AchE)的产物。HCNP在11天大鼠脑免疫反应阳性较强的部位，主要有大脑皮层、海马齿状回、杏仁核、脊髓三叉神经核和脊髓后角等，而在成年大鼠脑HCNP前身物信使RNA相对标记强的，主要分布在大脑皮层、海马、杏仁核、隔核、内侧缰核、黑质、小脑的蒲肯野氏细胞和颗粒层细胞等部位。

　　该发明的目的是提供一种具有拮抗吗啡抗伤害作用的抗阿片肽，99A和21Kd两种。

　　该发明所提供的抗阿片肽，命名为21Kd，是下述氨基酸残基序列之一：

　　1)序列表中的SEQIDNO：1；

　　2)将序列表中SEQIDNO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响，例如，增加的组氨酸标签等。

　　序列表中的SEQIDNO：1由186个氨基酸残基组成。

　　编码本发明抗阿片肽21Kd的基因，是下述核苷酸序列之一：

　　1)序列表中SEQIDNO：2的DNA序列；

　　2)编码序列表中SEQIDNO：1的DNA序列；

　　3)与序列表中SEQIDNO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

　　4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQIDNO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

　　所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNO：2由558个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。试验表明，上述抗阿片肽21Kd具有一系列的活性片段，它们可为下述氨基酸残基序列之一：

　　1)序列表中的SEQIDNO：3；

　　2)序列表中的SEQIDNO：4；

　　3)序列表中的SEQIDNO：5；

　　4)将序列表中SEQIDNO：3-5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。序列表中的SEQIDNO：3由13个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-13；序列表中的SEQIDNO：4由14个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-14；序列表中的SEQIDNO：5由21个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-21。编码上述抗阿片肽活性片段的基因、与该基因具有90％以上同源性的核苷酸序列或在高严谨条件下可与其限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，也受本发明的保护。所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

　　序列表中的SEQIDNO：6由39个碱基组成，编码SEQIDNO：3所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQIDNO：7由42个碱基组成，编码SEQIDNO：4所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQIDNO：8由63个碱基组成，编码SEQIDNO：5所示的抗阿片肽21Kd活性片段。

　　本发明抗阿片肽21Kd的拮抗肽，是下述氨基酸残基序列之一：

　　1)序列表中的SEQIDNO：9；

　　2)序列表中的SEQIDNO：10；

　　3)序列表中的SEQIDNO：11；

　　4)将序列表中SEQIDNO：9-11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。序列表中的SEQIDNO：9由13个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-13；序列表中的SEQIDNO：10由14个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-14；序列表中的SEQIDNO：11由21个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-21。编码上述抗阿片肽21Kd拮抗肽的基因、与该基因具有90％以上同源性的核苷酸序列或在高严谨条件下可与其限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，也受本发明的保护。所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

　　序列表中的SEQIDNO：12由39个碱基组成，编码SEQIDNO：9所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQIDNO：13由42个碱基组成，编码SEQIDNO：10所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQIDNO：14由63个碱基组成，编码SEQIDNO：11所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽。

　　含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增该基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

　　上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽可采用常规的人工合成方法直接获得，如可用fmoc保护的固相合成法等方法人工合成，或可委托专业的生物公司合成(如美联(西安)生物科技有限公司或上海闪晶生物多肽合成有限公司等)，此外，也可利用微生物发酵表达的方法获得。本发明所提供的表达上述拮抗肽的方法，是将含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到抗阿片肽21Kd的拮抗肽。

　　所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α或E.coliTop10等。用于构建所述含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pET-22b、pET-11c、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。

　　其中，以pET-22b为出发载体，构建的含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体为pET-CP-21Kd-8+5、pET-CP-21Kd-13、pET-CP-21Kd-14或pET-CP-21Kd-21。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

　　将上述重组表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法或PEG介导的原生质体转化法等。

　　培养含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度可为0.1-1.0mmol/L，优选为0.2mmol/L，诱导温度可为16-37℃，优选为30℃，诱导时间可为2-4小时，优选为3小时。

　　所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽在制备增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物中的应用也是本发明要保护的。当然，以所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽为活性成分的药物，更是本发明需要保护的内容，该药物具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状的作用。

　　以抗阿片肽21Kd的拮抗肽为活性成分的药物中，其活性成分可选自以下氨基酸残基序列中的一个或几个：

　　1)序列表中的SEQIDNO：9；

　　2)序列表中的SEQIDNO：10；

　　3)序列表中的SEQIDNO：11；

　　4)将序列表中SEQIDNO：9-11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的多肽。

　　需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。

　　本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

　　上述药物的成人用量一般为0.01-0.5mg/kg体重/次，可以一次或多次使用，疗程一般为10至20天。

　　该发明提供了一种从猪脑中分离纯化出的抗阿片肽21Kd及其活性片段，它具有拮抗吗啡抗伤害作用。吸毒过程伴随着毒品剂量的增加可促使该蛋白的合成增加，导致吗啡耐受及依赖的形成。本发明利用蛋白质分子之间存在相互作用的原理，根据其三个活性片段的序列，设计出了的该抗阿片肽21Kd的拮抗肽。实验证明，人工合成的拮抗肽可作为内源性抗阿片肽的抑制剂，通过静脉注射三个活性片段的拮抗肽，可以提高吗啡抗伤害作用的效应，减少吗啡用量，此外，这些拮抗肽的分子量小于2000道尔顿，较容易通过血脑屏障，在中枢神经系统的相关部位起到抵消内源性抗阿片肽效应的作用，因而可以将其作为活性成分制备成增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物。该药物具有以下优点：1)疗效显著：活性成分拮抗肽是通过消除吸毒者体内多余的内源性抗阿片肽及其效应来达到增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和消除或减弱吸毒者戒断症状的目的，可从源头上消除戒断症状；2)获得的拮抗肽都是一些氨基酸残基数量不超过25个的短肽，容易合成，便于开发研究；3)这些短肽进入体内容易被降解，不具备产生抗体的副作用，安全性高；4)用药方便，可通过静脉注射方式或舌下含片等多种方式给药，以消除或减弱吗啡戒断的症状；5)该短肽稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产，且生产成本低廉，可减轻病人的经济负担。本发明的抗阿片肽21Kd及其活性片段与其拮抗肽将在医学及戒毒药物的制备领域发挥重要作用，应用前景广阔。