一种抗阿片肽的拮抗肽与该拮抗肽的应用（二）

发布时间:2015-12-02

　　专利号：ZL201010581145.7

　　类型：发明

　　专利权人：北京大学  陈玉珍；吴才宏；曲红

　　本发明所提供的抗阿片肽，命名为99A，是下述氨基酸残基序列之一：

　　1）序列表中的SEQ ID NO：1；

　　2）将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

　　序列表中的SEQ ID NO：1由86个氨基酸残基组成。

　　编码本发明抗阿片肽99A的基因，是下述核苷酸序列之一：

　　1）序列表中SEQ ID NO：11的DNA序列；

　　2）编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

　　3）与序列表中SEQ ID NO：11限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有拮抗吗啡抗伤害作用的核苷酸序列；

　　4）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

　　所述高严谨条件为：用0.1×SSPE (或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

　　序列表中的SEQ ID NO：11由258个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

　　上述抗阿片肽99A的活性片段，可为下述氨基酸残基序列之一：

　　1）序列表中的SEQ ID NO：2；

　　2）序列表中的SEQ ID NO：3；

　　3）序列表中的SEQ ID NO：4；

　　4）将序列表中SEQ ID NO：2-4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

　　序列表中的SEQ ID NO：2由14个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的抗阿片肽命名为99A-16；序列表中的SEQ ID NO：3由19个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：3氨基酸残基序列的抗阿片肽命名为99A-19；序列表中的SEQ ID NO：4由14个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：4氨基酸残基序列的抗阿片肽命名为DBI-16。

　　编码上述抗阿片肽活性片段的基因，是下述核苷酸序列之一：

　　1）序列表中SEQ ID NO：12的DNA序列；

　　2）序列表中SEQ ID NO：13的DNA序列；

　　3）序列表中SEQ ID NO：14的DNA序列；

　　4）编码序列表中SEQ ID NO：2-4的DNA序列；

　　5）与序列表中SEQ ID NO：12-14限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有拮抗吗啡抗伤害作用中起重要作用的核苷酸序列；

　　6）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：12-14限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

　　所述高严谨条件为：用0.1×SSPE (或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

　　序列表中的SEQ ID NO：12由48个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：13由57个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：14由48个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质。

　　上述抗阿片肽99A的拮抗肽也是本发明要保护的，可为下述氨基酸残基序列之一：

　　1）序列表中的SEQ ID NO：5；

　　2）序列表中的SEQ ID NO：6；

　　3）序列表中的SEQ ID NO：7；

　　4）将序列表中SEQ ID NO：5-7的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受或/和减弱或消除戒断症状作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

　　序列表中的SEQ ID NO：5由21个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：5氨基酸残基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名为CP-99A-16+5；序列表中的SEQ ID NO：6由19个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：6氨基酸残基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名为CP-99A-19；序列表中的SEQ ID NO：7由19个氨基酸残基组成，将具有SEQ ID NO：7氨基酸残基序列的抗阿片肽的拮抗肽命名为CP-DBI-16+5。

　　编码本发明抗阿片肽99A拮抗肽的基因，是下述核苷酸序列之一：

　　1）序列表中SEQ ID NO：8的DNA序列；

　　2）序列表中SEQ ID NO：9的DNA序列；

　　3）序列表中SEQ ID NO：10的DNA序列；

　　4）编码序列表中SEQ ID NO：5-7的DNA序列；

　　5）与序列表中SEQ ID NO：8-10限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受或/和减弱或消除戒断症状中起重要作用的核苷酸序列；

　　6）在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：8-10限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

　　所述高严谨条件为：用0.1×SSPE (或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

　　序列表中的SEQ ID NO：8由63个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：9由57个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：10由63个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质。

　　含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增该基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

　　上述抗阿片肽99A的拮抗肽可采用常规的人工合成方法直接获得，如可用fmoc保护的固相合成法等方法人工合成，或可委托美联（西安）生物科技有限公司或上海闪晶生物多肽合成有限公司等生物公司合成，此外，也可用利用微生物发酵表达的方法获得。

　　本发明还提供了一种表达上述抗阿片肽99A的拮抗肽的方法。

　　本发明所提供的表达上述拮抗肽的方法，是将含有上述抗阿片肽99A的拮抗肽基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到抗阿片肽99A的拮抗肽。

　　所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

　　所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α或E.coli Top10等。

　　用于构建所述含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pET-22b、pET-11c、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。

　　以pET-22b为出发载体，构建的含有抗阿片肽99A的拮抗肽基因的表达载体为pET-CP-99A-16、pET-CP-99A-19或pET-CP-DBI-16。

　　上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

　　将上述重组表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法或PEG介导的原生质体转化法等。

　　培养含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度可为0.1-1.0mmol/L，优选为0.2mmol/L，诱导温度可为14-37℃，优选为30℃，诱导时间可为2-4小时，优选为3小时。

　　本发明的另一个目的是提供一种增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受或/和减弱或消除戒断症状的药物。

　　本发明所提供的药物的活性成分为上述抗阿片肽99A的拮抗肽；其中，所述抗阿片肽的拮抗肽选自以下氨基酸残基序列之一：

　　1）序列表中的SEQ ID NO：5；

　　2）序列表中的SEQ ID NO：6；

　　3）序列表中的SEQ ID NO：7；

　　4）将序列表中SEQ ID NO：5-7的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受或/和减弱或消除戒断症状作用的多肽。

　　所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

　　需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。

　　本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

　　上述药物的成人用量一般为0.01-0.5mg/kg体重/次，可以一次或多次使用，疗程一般为10至20天。

　　本发明提供从猪脑中分离纯化出一种抗阿片肽99A及其活性片段，它具有拮抗吗啡抗伤害作用，吸毒过程伴随着毒品剂量的增加可促使该蛋白的合成增加，导致吗啡耐受及依赖的形成。本发明是利用蛋白质分子之间存在相互作用的原理，依照三个活性片段的序列，设计出了它们的拮抗肽。由于这些拮抗肽的分子量小于2000道尔顿，较容易通过血脑屏障，在中枢神经系统的相关部位起到抵消内源性抗阿片肽效应的作用。实验证明人工合成的拮抗肽可作为内源性抗阿片肽的抑制剂，通过静脉注射三个活性片段的拮抗肽，可达到增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和减弱或消除戒断症状作用。该药物具有以下优点：1）疗效显著：活性成分拮抗肽是通过消除吸毒者体内多余的内源性抗阿片肽及其效应来达到增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和消除或减弱吸毒者戒断症状的目的，可从源头上消除戒断症状；2）获得的拮抗肽都是一些氨基酸残基残基数量不超过25个的短肽，容易合成，便于开发研究；3）这些短肽进入体内容易被降解，不具备产生抗体的副作用，安全性高；4）用药方便，可通过静脉注射方式或舌下含片等多种方式给药，以消除或减弱吗啡戒断的症状；本发明的抗阿片肽99A活性片段的拮抗肽将在医学及戒毒药物领域发挥重要作用，应用前景广阔。

　　合作方式：技术转让；技术许可；技术入股；申报国家计划