桑蚕病虫害检测防控技术

发布时间:2015-06-18

　　所属战略性新兴产业领域： 生物

　　所属高新技术领域： 现代农业

　　属其他学科、专业领域： 畜牧学科特种经济动物养殖(含蚕蜂等)

　　单位名称： 华南农业大学

　　成果简介：

　　1.1科技成果简介

　　根据华南蚕区蚕业生产中蚕病多发的现状，在研究重要传染性蚕病流行发生规律的基础上，研制了一套桑蚕病虫害的高效检测防控技术。建立了一种煮沸提取家蚕病原微孢子虫DNA的方法，此法简便、快捷，且适用于多种微孢子虫DNA的提取。研发了一种LAMP法检测家蚕病原微孢子虫的方法和诊断试剂盒，该法特异性强、快速、高效、敏感性高，从而简化了检测过程，比PCR法灵敏10~100倍。设计了一对特异的引物并应用RT-PCR技术实现对家蚕质型多角体病毒的检测，具有微量、快速、灵敏和特异性强等优点，可有效地扩增检测出家蚕中肠型脓病。建立的家蚕浓核病毒BmDNV的PCR检测技术，是基于煮沸沉淀法，实现快速准确地提取BmDNV的DNA，同时筛选BmDNV-3基因组的特异区段，设计了一对特异性引物应用于家蚕浓核病毒的PCR扩增检测。同时将以上技术分别研制生产了检测试剂盒，在生产中进行了推广应用，为生产上早期检测和预知检查家蚕中肠型脓病、浓核病、家蚕微粒子病提供技术支撑，通过降低蚕病的损失，进而提高农民的养蚕经济效益，对蚕丝产业的持续稳定发展提供了技术保障。

　　课题来源：国家蚕桑产业技术体系岗位专家CARS-22-ZJ0205(2008-2015年)、国家自然科学基金项目30671588(2009-2009年)、省科技攻关项目2004B50201019(2004-2006年)。

　　科技成果批准登记单位：广东省科学技术厅;批准登记号：粤科成登字20130340;批准登记日期：2013-5-29

　　成果创新性：

　　1.2创新性

　　与现有技术相比，本技术具有明显的实用性特点和显著的创新性。本技术建立的一种快速抽提微孢子虫DNA的方法，与当前普遍存在DNA提取步骤复杂、操作时间长的常规法、CTAB法等相比，其操作简单、快速、有效，仅需10min左右。将LAMP法应用于家蚕病原微孢子虫的检测，其特异性强，简便、高效，敏感性高，肉眼即可判断结果，从而简化了检测过程，比PCR法灵敏10~1000倍，检测时间也大大缩短。应用RT-PCR技术检测家蚕质型多角体病毒BmCPV，采用特异性引物BmCPVf/BmCPVr可以有效地扩增检测出BmCPV病毒，其特异性强，检测快速准确，更填补了当前对BmCPV基因快速检测技术的空白。采用煮沸沉淀法，仅需10min左右提取家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA，克服现有提取技术检出时间长、检出量少、灵敏度较低的不足，实现快速准确地提取所述病毒的DNA。设计的一对特异性引物VD2f/VD2r，更是解决了现有技术的敏感性问题，满足了PCR法对BmDNV进行分子诊断的需要。因此，本技术具有显著的创新性。

　　成果独占性：

　　1.3独占性

　　本技术均是获得发明专利授权的，成果是上述专利的集成，因此技术成果独占性明显。本技术中建立的煮沸抽提微孢子虫DNA 的方法已经被专利授权保护;同时结合LAMP法应用于家蚕微孢子虫的检测，其特异检测靶基因和引物也获得专利保护。其次应用RT-PCR技术检测BmCPV，其特异检测靶基因和引物也获得专利保护，并填补了当前国内外对家蚕BmCPV基因快速检测技术的空白。再次采用煮沸沉淀法提取BmDNV 的模板DNA，结合特异性引物VD2f/VD2r进行PCR技术检测BmDNV的技术也是获得发明专利的成果，上述专利技术成果集成的桑蚕病虫害检测防控技术，均有明显的技术创新性，应用中均难以获取或复制。

　　成果盈利性：

　　1.4盈利性

　　本技术建立了一种简易、快速、有效的核酸抽提方法，不仅为推广应用各种快速核酸诊断微孢子虫的方法提供了前提条件，更为各种诊断试剂盒的研发和推广降低了成本。建立的一套应用LAMP方法快速检测家蚕典型病原微孢子虫(N.bombycis)的技术，比PCR法的检测灵敏度高10~1000倍，无需用PCR仪器，前后检测过程仅需在一个普通恒温金属浴仪器里，耗时约2.5 h，就可完成反应和检测样本是否感病。而家蚕浓核病毒BmDNV检测专利技术结合煮沸沉淀法提取模板DNA和应用特异引物进行BmDNV的PCR检测，与传统的酚-氯仿法(约6 h)相比节约了4-5 h，极大地提高了BmDNV模板的制备效率，该试剂盒应用具有省时、敏感、特异性强等;而家蚕BmCPV基因快速检测技术的建立是国内外家蚕中肠型脓病分子检测上的空白。综上，基于专利技术成果集成的桑蚕病虫害检测防控技术，能够明显降低成本，提高蚕病的检测灵敏性等特点，在蚕业生产上应用潜力很大。

　　成果持续性：

　　1.5持续性

　　本项目所依托的华南农业大学蚕桑系、亚太地区蚕桑培训中心，经过仅百年的蚕桑学科的人才培养与科学研究，形成了具有鲜明亚热带特色的学科优势，学科水平和开展蚕桑国际交流合作能力处于全国同类高校同类学科中的前列。本技术成果是由国家蚕桑产业技术体系亚热带蚕病防控岗位科学家团队完成的，本科研团队是一支具有一直在蚕业生产一线开展教研工作和蚕病防控技术研发的人才队伍，学术积累深厚及科研配套设施齐全，结合亚热带蚕区蚕桑安全生产和发展的需要，正在研发一系列的蚕桑病虫害一体化管控技术和产品，已经(或正在)申报的蚕桑相关专利技术10多项，为实现蚕桑生产全环节的技术集成创新提供了有力的技术储备，为蚕桑行业的可持续性安全稳定发展提供技术支撑。

　　成果先进性：

　　1.6先进性

　　目前生产上的家蚕微粒子病的检测主要还是以光学显微镜检查为主，而免疫学检测法及PCR法等由于灵敏性低或操作繁琐等各种原因的限制，尚未见在生产上普及应用，本技术首次研发的结合煮沸法提取微孢子虫DNA，进行LAMP法检测家蚕微孢子虫的技术成果是国内外首创。而目前尽管BmCPV-I株的dsRNA基因全序列已被测定，相关的基因功能分析及蛋白结构的预测等多有报道，但对蚕桑生产上家蚕中肠型脓病病原BmCPV的分子生物学检测技术的研究报道还较少，也尚无应用RT-PCR法检测BmCPV的技术报道，本技术成果则填补了这一技术空白。再次国内外在应用PCR 技术诊断检测家蚕浓核病和研究家蚕浓核病毒BmDNV的基因方面，多有文献报道，但其检测过程繁杂、敏感性偏低，本技术成果提供的结合煮沸法进行特异区段靶基因的PCR扩增检测技术，具有快捷、敏感等特点，适合生产上推广应用。

　　目前中国是世界蚕丝业的生产大国，我们的蚕病检测防控技术是国际领先的，在桑蚕病虫害分子检测技术方面具有明显的技术优势。基于国内外家蚕病原分子检测技术的发展，未来简便、快捷有效地获得模板DNA，是推广应用分子检测试剂盒的首选技术，而基于类似核酸恒温扩增显色技术LAMP法的应用和推广，必将是疾病分子诊断技术的未来趋势。

　　成熟度： 大批量

　　市场分析：

　　2.1市场分析

　　蚕桑是中国的传统优势特色产业，蚕桑生产对环境条件和技术的要求较高，养蚕技术不规范、消毒不彻底和使用劣质蚕种，容易导致蚕病暴发，最终都会影响蚕茧产量与质量，影响蚕农的收益，严重的导致蚕茧颗粒无收。基于蚕病快速诊断技术和方法的研制是蚕业界研究中重要的课题之一，建立桑蚕病的检测及综合防控技术体系，预防与控制病虫害的爆发，是化解蚕业自然风险的有效对策。目前国内外对家蚕病原的检测方法普遍存在诸如耗时费力、特异性不强且不适于野外检测、不利于生产应用等不足，严重影响蚕丝蚕业的持续健康稳定的发展。本技术成果是在多年研究重要传染性蚕病流行发生规律、筛选抗性品种、开展各类疾病的分子流行病学调查以及开发基因水平的快速诊断试剂盒的基础上形成的，建立的一套桑蚕病虫害的高效检测防控技术，是国内外首创，并填补了多项蚕病分子检测技术上的空白，研发生产的家蚕微孢子虫LAMP检测试剂盒、BmCPV的RT-PCR检测技术和配套试剂盒、及BmDNV的PCR检测技术和配套试剂盒等均是发明专利成果，一系列桑蚕病虫害的诊断试剂盒经粤桂湘等华南蚕区的生产中试，同时配合蚕病综合防治措施的实施，实现了蚕桑生产的持续稳定的发展，蚕桑生产效益获得了明显提高。综上，本技术由于拥有多项技术发明专利，因此具有明显的核心竞争优势，市场占有率为100%，且本技术适合国内外70多个养蚕国家蚕区开展养蚕生产的疾病诊断全过程。

　　此外，家蚕微孢子虫LAMP检测试剂盒同样适用相关经济昆虫如柞蚕、蜜蜂等的微粒子病的直接检测应用;而BmCPV的RT-PCR检测技术和配套试剂盒、及BmDNV的PCR检测技术和配套试剂盒等也适用为各类作物鳞翅目昆虫相关疾病的诊断和检测应用。

　　商业模式分析：

　　2.2商业模式分析

　　本技术成果的推广采用产学研合作模式。本单位负责提供技术及人才支持，协助客户和主要应用单位进行产品的进一步研发和技术培训，实现试剂盒生产单位的自主创新能力和产品的辐射带动能力，是产品供应商与蚕桑生产者的纽带和桥梁。

　　合作生产单位(产品的供应商)负责提供资金支持及市场开发和推广销售，实现科技成果的有效转化，作为技术成果的生产实施单位，应为本技术成果的研发单位一次性提供不少于30万元人民币的科研经费补偿，并在本技术成果产品的推广获益中提供总利润的5~10%作为研发单位的再创新研究。

　　研发单位利用产品生产单位提供的研发经费，为产品的后续生产过程的产业化生产提供技术保障和支撑。合作生产单位(产品的供应商)必须及时反馈用户及市场对产品的需求及客户的反映，及时沟通，共同推进产品有效推广应用，获得的推广荣誉奖励为双方共享。

　　营销状况：

　　2.3营销状况

　　本技术在粤、湘、桂等蚕区的蚕种场、蚕业产品质检中心的应用，反馈效果良好，为当地家蚕病原的检测和防控提供了技术支撑，有效地解决了家蚕微粒子病、病毒病等监测难、成本高、成效微等问题，产生了较好的经济效益和显著的社会效益，为当地的蚕桑持续稳定的发展提供了技术支撑。

　　家蚕微粒子病LAMP检测试剂盒以生产1万份检测样品合计，成本价为每份8元/检测反应的样品(如果生产量大的话，产品成本估计在5元/检测反应左右)，目前的市场销售价暂定为每份12元/检测样品。目前以华南蚕区的两广蚕区每年生产蚕种约300万张(盒)蚕种为例，实际销售蚕种约500万张(盒)蚕种，如果全面推广此项技术检测的话，华南蚕区市场每年需要至少在100万(份)检测反应的试剂盒;此外，BmCPV和BmDNV的检测则是全年生产上都需要的，每年至少也在100万(份)检测反应的试剂盒以上需求水平上。

　　产品推广模式主要是“企业+高校+基地”的直销为主，企业自主开发市场并进的模式。在“企业+高校+基地”的直销模式上，以两广蚕区为技术推广和示范为依托，借助本技术依托单位的亚太地区蚕桑培训中心平台和华南农业大学蚕桑系的技术力量，利用每年承担商务部下达的国际蚕业培训的契机，以及相关的国内技术培训，将本技术成果推广辐射到全国和东南亚蚕区，同时带动相关蚕种等蚕用物资、缫丝设备等的销售。

　　现有的典型的试用客户是广东省蚕业产品检测中心和湖南省蚕种质量检测站，客户反映效果良好。

　　拟采取的转化方式： 技术许可

　　应用推广的已投入情况： 182万元

　　资金需求额： 50 万元

　　融资用途： 产品研发;市场开拓

　　评价机构： 广东省知识产权局，8620-87682346

　　评价方式： 其他

　　评价日期： 2013年4月27日

　　评价意见：

　　7.3评价意见

　　本项目实施后，广东省及华南地区家蚕病毒病危害控制在较低的水平，蚕种微粒子病淘汰率在1%以下，经济效益达3000万元，有力促进各地蚕业的稳定健康发展。

　　该项目的实施，保障了蚕农经济收益稳定增长，蚕丝产业的安全生产得到保证，推动了蚕桑业的可持续、健康稳定发展。

　　根据《广东省科技成果评价方法(试行)》(粤科成字[1999]239号)第十六条第一款的精神，经审查，予以专利成果确认。